NIPT – SÀNG LỌC TRƯỚC SINH KHÔNG XÂM LẤN Quản lý chất lượng và sự tin cậy ThS.BS. Lê Thị Khánh Linh Khoa Xét nghiệm Di truyền Y học Bệnh viện Từ Dũ 1
Giới thiệu NIPT Sàng lọc trước sinh không xâm lấn (NIPT) Dựa vào phân tích DNA tự do • Nguồn gốc: nhau thai (cfDNA) trong máu mẹ. • 5-7 tuần vô kinh- sau sinh 2 tiếng • DNA trần • cfDNA mẹ và con • Fetal fraction
Công nghệ xét nghiệm NIPT • MPS (massively parallel sequencing) • “counting method” • Chỉ số z-score • Targeted sequencing • CSS (chromosome-selective sequence) • Điểm nguy cơ (risk score) • SNPs sequencing • Phân tích tính đa hình • Vanadis NIPT system biochemistry • Lai huỳnh quang J. Fetal Med. 2015;2(1):11-7 NGS – next generation sequencing
Công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới ? Thai bình thường Thai bất thường Chỉ 1.36% cfDNA là Chr. 21 Chỉ 1.42% cfDNA là Chr. 21 10% fetal fraction => chỉ có 0.136% cf DNA thai 10% fetal fraction => chỉ có 0.142% cf DNA thai Chỉ có 0.06% khác biệt !
SOP NGOẠI CHUẨN HOÁ QUY KIỂM TRÌNH QUẢN LÝ CHẤT LƯỢNG NỘI ĐÀO TẠO KIỂM NHÂN SỰ
CE/IVD - RUO • RUO (Research Use Only): chỉ sử dụng trong nghiên cứu • CE-IVD (European Conformity In Vitro Diagnostic): chẩn đoán trên người theo tiêu chuẩn của Châu Âu.
Chuẩn hoá Quy trình NIPT
Quy trình NIPT tại BV Từ Dũ
Mẫu máu: thu nhận và bảo quản Chất kháng đông K3EDTA
Tách plasma Tách plasma từ máu toàn phần: EDTA/Streck Tube Centrifugation 3000g ~10 mL ~5 mL ~5 mL Chậm Nhanh Ly tâm 16 000g Ly tâm 1 600g (10 minutes) (10 phút) Tách chiết DNA © 2018 Premaitha Health - Confidential
Tách chiết DNA tự do (cell-free DNA) Plasma Ủ Ủ QIAvac 24 + Proteinase K 60C trong 30 phút + Buffer ACL + Buffer ACB QIAGEN QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (cat 55114) ~ 2-3giờ
Chuẩn bị thư viện DNA DNA fragments from plasma + Buffer + Enzymes Ủ Plate 1
Định lượng cfDNA sau PCR q Chất lượng : kiểm tra các đoạn Kiểm tra DNA (kích thước, độ nhiễu..) chất lượng q Số lượng : Đo nồng độ DNA mỗi mẫu Marqueur 1 DNA Fragment GX Reviewer
Tổ hợp DNA và đo kích thước DNA DNA được: vChuẩn hoá vKết hợp 12 mẫu Pool 1 Pool 2 12 Mẫu/pool
Định lượng DNA lần hai GX Reviewer Post-SS Pool Đo nồng độ DNA bằng Labchip GX Touch. Pool 1 .
Chuẩn bị mẫu và Giải trình tự
Kiểm soát chất lượng ……..… PCR Đánh giá quy trình ……… Đánh giá quy trình …… Đánh giá mẫu …… …… Đánh giá quy trình Đánh giá mẫu
GC content • Tỷ lệ Guanine-Cytosine trên NST • Chiếm 40% DNA trong genome • Thay đổi tỷ lệ trình tự đọc của NST cần phân tích và NST tham khảo • Ảnh hưởng đến việc xác định sự khác biệt về số lượng trong trình tự đọc • GC correction: loại bỏ ảnh hưởng của trình tự GC, cải thiện độ nhạy và độ đặc hiệu
Đánh giá chất lượng giải trình tự NGS