C«ng tr×nh nghiªn cøu KHOA HỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC HẢI PHÒNG ỨNG DỤNG KỸ THUẬT REALTIME–PCR VÀ SEVERSE DOT BLOT XÁC ĐỊNH TỶ LỆ NHIỄM VÀ GENOTYPE CỦA HUMAN PAPILLOMAVIRUS Ở BỆNH NHÂN KHÁM SẢN PHỤ KHOA, DA LIỄU TẠI BỆNH VIỆN ĐẠI HỌC Y HẢI PHÒNG Trịnh Văn Khương1,2, Hoàng Thị Hải Yến1, Vũ Thị Hằng2, Phạm Thị Thanh Bình2, Nguyễn Hùng Cường1,2, Đào Thị Hương3 TÓM TẮT 14 Từ khóa: Realtime–PCR, Severse dot Blot, Human papillomavirrus (HPV) là tác nhân Tỷ lệ nhiễm, genotype, HPV. phổ biến nhất trong các nhiễm trùng lây truyền qua đường sinh dục. Mục tiêu: xác định tỷ lệ SUMMARY nhiễm và sự phân bố genotype HPV ở bệnh nhân APPLICATION OF REALTIME-PCR khám bệnh tại Bệnh viện Đại học Y Hải Phòng. AND REVERSE DOT BLOT Đối tượng và phương pháp: Nghiên cứu mô tả TECHNIQUE IN ESTABLISHING cắt ngang, sử dụng kỹ thuật Real - time PCR và INFECTION RATE AND GENOTYPE Severse Dot Blot được tiến hành trên 212 bệnh OF HUMAN PAPILLOMAVIRUS nhân tới khám tại phòng khám da liễu và phòng AMONG PATIENTS WITH khám sản phụ khoa của Bệnh viện Đại học Y Hải GYNAECOLOGICAL EXAMINATION Phòng. Kết quả: cho thấy 24,05% (51/212) bệnh AT HAIPHONG MEDICAL nhân nhiễm HPV, trong đó phần lớn là nhiễm UNIVERSITY HOSPITAL đơn genotype 64,7%. Genotype HPV11 chiếm tỷ Human papillomavirrus (HPV) has been one lệ cao nhất (38%), tiếp đến là Genotype HPV6 of the most common agents in sexually (18%), Genotype HPV16 và Genotype HPV18 transmitted infections (STIs). Objective: cùng chiếm tỷ lệ 16%; 12% dương tính với 1 determine the infection rate and the distribution trong 05 Genotype ( 33, 35, 51, 58, 81). Kết of HPV genotype among patients at Hai Phong luận: Kết quả nghiên cứu này đóng góp thêm Medical University Hospital. Subjects and vào dữ liệu về tỷ lệ nhiễm và sự phân bố kiểu gen methods: this is a descriptive cross-sectional của HPV. study, using Real – time PCR and Reverse Dot Blot technique on samples from 212 outpatients who visited dermatology clinic and obstetrics 1 Trường Đại Học Y Dược Hải Phòng clinic of Hai Phong Medical University Hospital. 2 Bệnh viện Đại học Y Hải Phòng Results: the infection rate was 24.05% (51/212) 3 Tổng Công Ty Bảo Đảm An Toàn Hàng Hải patients having HPV with the majority of which Miền Bắc being single type infection (64.7%). The Chịu trách nhiệm chính: Trịnh Văn Khương dominated genotype was HPV11 with 38%, Email: tvkhuong@hpmu.edu.vn followed by HPV6 (18%), while both HPV16 Ngày nhận bài: 20.1.2022 and HPV18 accounted for 16%. Meanwhile, 12% Ngày phản biện khoa học: 19.3.2022 patients were positive with 1 in 5 types (33, 35, Ngày duyệt bài: 20.5.2022 51, 58, 81). Conclusions: Acquired results from 100
TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 515 - THÁNG 6 - SỐ ĐẶC BIỆT - PHẦN II - 2022 this study could help contribute to the database of HPV như phương pháp lai phân tử, DNA infection rate and HPV genotype distribution. Microarray, Sequencing,… Trong đó, Keywords: Realtime–PCR, Severse dot-blot, phương pháp lai phân tử (Reverse dot blots) HPV infection rate, HPV genotype. cho phép xác định được 24 Genotype HPV khác nhau trong cùng một phản ứng, thể hiện I. ĐẶT VẤN ĐỀ khi đọc kết quả phản ứng trên mẫu bệnh Human Papillomavirus (HPV) là tác nhân phẩm. Còn những phương pháp giải trình tự thường gặp nhất trong các nhiễm trùng lây gen vẫn chưa phải là một xét nghiệm thường truyền qua đường tình dục và là nguyên nhân quy do giá thành xét nghiệm cao, không phát chính gây ung thư cổ tử cung trên toàn thế hiện được các trường hợp đồng nhiễm nhiều giới, đặc biệt là những nước đang phát triển Genotype HPV trong cùng một phản ứng. nơi mà 85% các trường hợp vong do mắc Chính vì vậy, nghiên cứu này được tiến ung thư tử xảy ra ở đây [1]. hành nhằm: xác định tỷ nhiễm và genotype HPV thuộc họ Papillomaviridea với của HPV ở bệnh nhân tại Bệnh viện Đại học khoảng 120 genotype khác nhau đã được xác Y Hải Phòng để phòng, điều trị UTCTC và định và dựa trên khả năng gây ra các tổn góp phần hoạch định chiến lược vaccin dự thương mô học, đặc biệt là khả năng gây ung phòng làm giảm gánh nặng toàn cầu của thư cổ tử cung, HPVđược chia làm 2 nhóm: bệnh UTCTC. Nhóm nguy cơ cao (High risk Human papillomavirrus: HR-HPV) bao gồm II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Genotype HPV16, 18, 31, 33, 35, 45, 52, và 2.1. Đối tượng, thời gian, địa điểm 58,… và Nhóm nguy cơ thấp (Low risk nghiên cứu Human papillomavirrus: LR-HPV) gồm các Đối tượng nghiên cứu là hồ sơ bệnh án Genotype HPV6, 11, 40, 42, 43, 54, 61, 70, của bệnh nhân tới khám tại phòng khám da 72,…)[2], [3], [4]. liễu và phòng khám sản phụ khoa của Bệnh Tại Việt Nam, tỷ lệ nhiễm HPV trong viện Đại học Y Hải Phòng. cộng đồng dân cư nữ từ 2% đến 10,9% thay Tiêu chuẩn lựa chọn: Là bệnh nhân của đổi theo vùng địa lý [1]. Các nghiên cứu phòng khám da liễu và phòng khám sản phụ trước đây đã xác định Genotype HPV16 và khoa, đồng ý tham gia nghiên cứu, có các Genotype HPV58 là các loại Genotype HPV triệu chứng lâm sàng nghi ngờ nhiễm HPV có nguy cơ cao phổ biến nhất trong dân số được khám bởi các bác sĩ chuyên khoa. nói chung của phụ nữ Việt Nam. Tuy nhiên Tiêu chuẩn loại trừ: Những bệnh nhân nhiễm Genotype HPV52 phổ biến nhất ở đối không được chỉ định làm xét nghiệm HPV. tượng gái mại dâm phía Bắc Việt Nam [1]. Thời gian nghiên cứu: Nghiên cứu được Hiện nay có rất nhiều phương pháp phát tiến hành từ ngày 3/1/2018 đến 30/12/2019. hiện nhiễm HPV như lai phân tử (Southern- 2.2. Phương pháp nghiên cứu blot, Dot-blot và Slot-blot, lai huỳnh quang), 2.2.1. Thiết kế nghiên cứu PCR, Real – time PCR, DNA microarray Nghiên cứu hồi cứu mô tả cắt ngang. (phương pháp DNA chip), Sequencing, 2.2.2. Cỡ mẫu và cách chọn mẫu phương pháp mô bệnh học,… Cũng đã có rất Nhóm nghiên cứu lựa chọn tất cả các hồ nhiều phương pháp để xác định genotype của sơ bệnh án có chỉ định làm xét nghiêm HPV 101
C«ng tr×nh nghiªn cøu KHOA HỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC HẢI PHÒNG từ 3/01/2018 đến 31/12/2019. Kết quả nhóm 59, 66, 68, 81 và 8 kiểu Genotype HPV có nghiên cứu lựa chọn được 212 bệnh án, với nguy cơ thấp: 6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 79. độ tuổi từ 21 – 69. Xác định Genotype HPV bằng cách quan Mẫu nghiên cứu được thu thập theo sát trực tiếp màu trên màng lai ứng với vị trí phương pháp thuận tiện, chọn tất cả các bệnh HPV DNA probe định sẵn. án đủ tiêu chuẩn trong suốt thời gian nghiên 2.3. Phương pháp phân tích và xử lý số cứu. liệu 2.2.3. Nội dung nghiên cứu Số liệu thu thập được phân tích và xử lý Mẫu bệnh phẩm bằng phần mềm thống kê y học SPSS 20.0. Mẫu bệnh phẩm tế bào bong của cổ tử 2.4. Đạo đức nghiên cứu: Tuân thủ tuyệt cung sẽ được lấy bằng bàn chải tế bào; mẫu đối quy định về đạo đức trong nghiên cứu. sùi, u nhú hay mụn cóc sẽ được sinh thiết, Các đối tượng hoàn toàn tự nguyện tham gia sau đó bảo quản trong eppendorf chứa 0,5 ml và có quyền rút lui khỏi nghiên cứu khi nước muối sinh lý và gửi đến khoa xét không đồng ý tiếp tục tham gia. Số liệu và nghiệm. thông tin được đảm bảo chính xác, bí mật. Kỹ thuật phân tích Tách DNA III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU DNA tổng số của HPV sẽ được tách chiết Tuổi trung bình của đối tượng nghiên cứu bằng phương pháp Phenol – Chloroform quy là 33,6 ± 9,4 với 76,8% bệnh nhân nữ. trình của bộ kítiVAaDNA Extraction Kit P 24,05% (51/212) bệnh nhân nhiễm HPV, (Công ty Cổ phần Công nghệ Việt Á) theo trong đó 64,7% (33/51) trường hợp nhiễm là hướng dẫn của nhà sản xuất. nữ và nhóm tuổi 26-35 có tỷ lệ nhiễm HPV Xác định HPV cao nhất là 45,1%. Thực hiện khuếch đại DNA của HPV Chúng tôi đã phát hiện được 09 genotype bằng phản ứng Real-time PCR: trên máy trong tổng số 24 genotype có thể xác định Icycler IQ5 của hãng BIORAD (Mỹ) theo được bằng kỹ thuật này. Trong đó, 64,7% các bước: 1 chu kỳ ở 95οC trong 5 phút, 40 (33/51) trường hợp đơn nhiễm một genotype chu kỳ gồm: 95ο/15 giây, 55ο/1 phút và HPV thuộc cả hai nhóm nguy cơ: Đơn nhiễm 72ο/20 giây. genotype nguy cơ thấp chiếm 58,8% (30/51) Xác định Genotype HPV và đơn nhiễm genotype nguy cơ cao chiếm Thực hiện kỹ thuật Reverse Dot-Blot xác 5,9% (3/51). Đặc biệt, có 31,3% (16/51) định genotype HPV: sản phẩm PCR có bệnh nhân có sự đồng nhiễm 2 genotype, 1 kết quả dương tính với HPV được sử dụng bệnh nhân đồng nhiễm 3 genotype (HPV11, để tiến hành kỹ thuật lai DNA với các đầu dò 33, 35) và 1 bệnh nhân đồng nhiễm với 4 DNA đặc hiệu cho các kiểu gen HPV (được genotype (HPV11, 18, 51, 58). Đồng nhiễm gắn sẵn trên màng lai) theo quy trình của bộ genotype nguy cơ cao chiếm 17,6% (9/51), kít LightPoweriVAHPV Genotype PCR-RDB đồng nhiễm nhiễm genotype nguy cơ cao + (Công ty Cổ phần Công nghệ Việt Á) để xác nguy cơ thấp chiếm 13,7% (7/51), đồng định kiểu gen. Với bộ kít này sẽ phát hiện nhiễm genotype nguy cơ thấp + nguy cơ thấp được 16 kiểu Genotype HPV có nguy cơ cao: chiếm 3,9% (2/51), trong đó đồng nhiễm 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, HPV16 và HPV18 chiếm 15,6% (8/51). 102
TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 515 - THÁNG 6 - SỐ ĐẶC BIỆT - PHẦN II - 2022 Nhiễm HPV 24,05% Không nhiễm HPV 75,95% Nhận xét: Có 51/212 bệnh nhân nhiễm HPV chiếm tỷ lệ 24,05%. Bảng 1: Phân bố tỷ lệ nhiễm theo nhóm Hình 1:HPV tuổi của Tỷ lệ nhiễm HPV Nhóm tuổi HPV (+) HPV (-) Tổng ≤ 25 14 29 43 26 - 35 23 60 83 > 35 14 72 86 Tổng 51 161 212 Nhận xét: Nhóm tuổi 26-35 có số trường hợp nhiễm HPV cao nhất với 23/51 chiếm 45,1%. Trong nhóm tuổi dưới 25 thì tỷ lệ dương tính với HPV là 14/43 (32,5%), trong nhóm tuổi trên 35, tỷ lệ dương tính là 14/86 (16,2%). 103
C«ng tr×nh nghiªn cøu KHOA HỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC HẢI PHÒNG Nhận xét: Phát hiện được 09 genotype trong tổng số 24 genotype có thể xác định được bằng kỹ thuật này. Nghiên cứu đã phát hiện tỷ lệ nhiễm HPV11 cao nhất (38%), tiếp đến HPV6 (18%) HPV16 (16%) và HPV18 (16%). Bảng 2: Đơn nhiễm và đồng nhiễm HPV genotype Đơn nhiễm và đa nhiễm HPV genotype n % Đơn nhiễm 33 64,7 Đơn nhiễm HPV genotype nguy cơ thấp 30 58,8 Đơn nhiễm HPV genotype nguy cơ cao 3 5,9 Đồng nhiễm 18 35,3 Đồng nhiễm HPV genotype nguy cơ cao 9 17,6 Đồng nhiễm HPV genotype nguy cơ cao 7 13,7 và HPV genotype nguy cơ thấp Đồng nhiễm HPV genotype nguy cơ thấp 2 4,0 Nhận xét: Tỷ lệ đơn nhiễm genotype HPV 64,7% và tỷ lệ đồng nhiễm genotype HPV chiếm 35,3%, đặc biệt trong nhóm đồng nhiễm có 16/51 (31,3%) đồng nhiễm 2 genotype, (4,0%) đồng nhiễm với 3 và 4 genotype khác nhau. Đồng nhiễm genotype nguy cơ cao chiếm 17,6% (9/51) trong đó đồng nhiễm HPV16 và HPV18 chiếm 15,6% (8/51), đồng nhiễm genotype nguy cơ cao + nguy cơ thấp chiếm 13,7% (7/51), đồng nhiễm genotype nguy cơ thấp + nguy cơ thấp chiếm 3,9% (2/51), Bảng 3: Kết quả Thinprep PAP Kết quả tế bào CTC n = 198 Tỷ lệ % Phiến đồ bình thường 164 82,8 ASCUS 20 10,1 LSIL 7 3,5 HSIL 4 2,1 K biểu mô vảy 2 1,0 K biểu mô tuyến 1 0,5 Nhận xét: Tỷ lệ bệnh nhân có kết quả Thinprep Pap bất thường là 16,7%, với 2 bệnh nhân được chẩn đoán là K tế bào xâm lấn và K biểu mô tuyến trong cổ tử cung. Bảng 4: Kết quả Thinprep PAP TBCTC TBCT OR (95% Đặc điểm bình thường bất thường CI) Không 132 15 5,22 Nhiễm HPV Có 32 19 (2,39 – 11,39) Tổng 164 34 Nhiễm HPV type nguy Không 155 15 6,20 cơ cao Có 09 09 (2,24 – 17,12) 104
TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 515 - THÁNG 6 - SỐ ĐẶC BIỆT - PHẦN II - 2022 Tổng 164 34 Không 139 24 Nhiễm HPV type nguy 2,31 Có 25 10 cơ thấp (0,99 – 5,43) Tổng 164 34 Nhận xét: Phụ nữ nhiễm bất kỳ type HPV nào sẽ có kết quả xét nghiệm tế bào CTC bất thường cao gấp 5,22 lần so với người không nhiễm. Phụ nữ nhiễm bất kỳ type HPV nguy cơ cao nào sẽ có kết quả xét nghiệm tế bào cổ tử cung bất thường cao gấp 6,20 lần sao với người không nhiễm. IV. BÀN LUẬN theo tác giả Kehinde Sharafadeen Okunade Tỷ lệ nhiễm HPV của bệnh nhân đến (Nigeria) có đến 46,6% bệnh nhân ở nhóm khám sản phụ khoa và khám da liễu tại bệnh tuổi này dương tính với HPV, Young-Tak viện Đại học Y Hải Phòng tương đồng với tỷ Kim (Korea) tỷ lệ nhiễm HPV cao nhất là ở lệ nhiễm HPV của bệnh nhân đến khám ở nhóm tuổi cao nhất [5], Kehinde Sharafadeen Okunade 0,05. Trong nhóm tuổi dưới 25 (độ tuổi còn (Nigeria) cho thấy HPV31 (25%) là chiếm có thể tiêm vaccin phòng HPV) thì tỷ lệ ưu thế nhất, tiếp theo là HPV35 (8,0%) và dương tính với HPV là 14/43 (32,5%), theo HPV16 (3,5%). Hoàng Thị Thanh Huyền sử MboumbaBouassa R-S (N’Djamena, Chad) dụng kỹ thuật GeneSquare HPV Typing phụ nữ từ 25 đến 29 tuổi bị nhiễm nhiều loại DNA Microarray Kit trên đối tượng gái mại HPV nhất [2]. Trong nhóm tuổi dưới 35, tỷ dâm tại Hải Phòng lại cho thấy HPV52 lệ dương tính với HPV là 23/83 (27,7%), (13,33%) là phổ biến nhất, tiếp theo là 105
C«ng tr×nh nghiªn cøu KHOA HỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC HẢI PHÒNG HPV16 (12,53%) và HPV58 (8,09%), là khác so với các đối tượng nghiên cứu của HPV18 (6,5%) [1]. Sự khác biệt về kết quả các nghiên cứu trên. nghiên cứu sự phân bố genotype HPV có thể Tỷ lệ bệnh nhân có kết quả Thinprep Pap do sự khác nhau của việc lựa chọn đối tượng bất thường là 16,7%, với 2 bệnh nhân được trong nghiên cứu. chẩn đoán là K tế bào xâm lấn và K biểu mô Tỷ lệ đơn nhiễm genotype HPV 64,7% và tuyến trong cổ tử cung. KQNC của chúng tôi tỷ lệ đa nhiễm genotype HPV chiếm 35,3%, cao hơn so với NC của tác giả Lê Tuấn Anh đặc biệt trong nhóm đa nhiễm có 16/51 thực hiện (năm 2018) tại Hà Nội và TP HCM (31,3%) đồng nhiễm 2 genotype, (4,0%) lần lượt là 14,9% và 12,3% [8]. đồng nhiễm với 3 và 4 genotype khác nhau. Bảng 4 chỉ ra rằng những phụ nữ nhiễm Kết quả nghiên cứu của chúng tôi tương bất kỳ type HPV nào sẽ có kết quả xét đồng với kết quả nghiên cứu của Kehinde nghiệm tế bào CTC bất thường cao gấp 5,22 Sharafadeen Okunade (Nigeria) với tỷ lệ lần so với người không nhiễm. Phụ nữ nhiễm 76,1%, Zheng Li (China) 82% và Kyeong A bất kỳ type HPV nguy cơ cao nào sẽ có kết So (Korea) có tỷ lệ 77,9% [7] các mẫu xét quả xét nghiệm tế bào cổ tử cung bất thường nghiệm chỉ dương tính với một loại HPV cao gấp 6,20 lần sao với người không nhiễm. genotype duy nhất. Trái ngược với nghiên Phụ nữ nhiễm bất kỳ type HPV nguy cơ thấp cứu của tác giả Hoàng Thị Thanh Huyền nào sẽ có kết quả xét nghiệm tế bào cổ tử (2013) với tỷ lệ đa nhiễm chiếm đa số cung bất thường cao gấp 2,31 lần sao với (67,89%) trong đó, tất cả các trường hợp đa người không nhiễm. KQNC của chúng tôi nhiễm đều nhiễm ít nhất một HPVgenotype cao hơn so với NC của tác giả Lê Tuấn Anh “nguy cơ cao” [1] vì tác giả này nghiên cứu thực hiện (năm 2018) tại Hà Nội và TP HCM trên đối tượng gái mại dâm. lần lượt là 3,8%, 4,2% và 1,7% [8]. Khi chia theo nhóm nguy cơ, LR-HPV 56% và HR-HPV 44% . Nghiên cứu của V. KẾT LUẬN chúng tôi có kết quả tương tự kết quả nghiên Tỷ lệ nhiễm HPV của bệnh nhân đến cứu của Kehinde Sharafadeen Okunade khám tại BVĐHY HP là 24,05%. Tỷ lệ này (Nigeria) với LR-HPV chiếm 73,5%. Tuy cao nhất ở những bệnh nhân thuộc nhóm tuổi nhiên, một số nghiên cứu khác lại chỉ ra HR- 26 - 35. HPV là chiếm ưu thế: nghiên cứu của Nghiên cứu đã xác định được 09 genotype Kyeong A So (Korea) HR-HPV chiếm đến HPV. Các genotype HPV “nguy cơ thấp” 97,4% [7], Zheng Li (China) HR-HPV chiếm chiếm đa số (56%), genotype “nguy cơ cao” tỷ lệ 81,4%, Hoàng Thị Thanh Huyền (2013) chiếm 44%. Genotype HPV11 chiếm tỷ lệ 75,2% [1]. Sự khác nhau này có thể lý giải là cao nhất (38%), tiếp đến là HPV6 (18%) và do đối tượng nghiên cứu chúng tôi lựa chọn HPV16, HPV18 cùng chiếm 16%. Tình trạng đơn nhiễm genotype HPV của bệnh nhân đến 106
TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 515 - THÁNG 6 - SỐ ĐẶC BIỆT - PHẦN II - 2022 khám tại BVĐHY HP là 64,7% và tỷ lệ đồng papillomavirus prevalence. BMC Infect Dis. nhiễm genotype HPV chiếm 35,3%. 2012;12(1):243. doi:10.1186/1471-2334-12- 243 TÀI LIỆU THAM KHẢO 5. Tricco AC,et al., Canadian oncogenic human 1. Hoang HTT, et al., Infection with high-risk papillomavirus cervical infection prevalence: HPV types among female sex workers in Systematic review and meta-analysis. BMC northern Vietnam. J Med Virol. Infect Dis. 2011;11:235. doi:10.1186/1471- 2013;85(2):288-294. doi:10.1002/jmv.23456 2334-11-235 2. Bouassa R-SM, et al., High prevalence of 6. Ogembo RK, et al., Prevalence of Human cervical high-risk human papillomavirus Papillomavirus Genotypes among African infection mostly covered by Gardasil-9 Women with Normal Cervical Cytology and prophylactic vaccine in adult women living in Neoplasia: A Systematic Review and Meta- N’Djamena, Chad. PLOS ONE. Analysis. Schabath MB, ed. PLOS ONE. 2019;14(6):e0217486. 2015;10(4):e0122488. doi:10.1371/journal.pone.0217486 doi:10.1371/journal.pone.0122488 3. Jiang L, et al., HPV prevalence and genotype 7. So KA, et al., Human papillomavirus distribution among women in Shandong genotype-specific risk in cervical Province, China: Analysis of 94,489 HPV carcinogenesis. J Gynecol Oncol. genotyping results from Shandong’s largest 2019;30(4):e52. doi:10.3802/jgo.2019.30.e52 independent pathology laboratory. Qu F, ed. 8. Lê Anh Tuấn (2021), Tỷ lệ nhiễm HPV và PLOS ONE. 2019;14(1):e0210311. kết quả xét nghiệm Thinprep PAP của phụ nữ doi:10.1371/journal.pone.0210311 bán dâm ở Hà Nội và Thành phố Hồ Chí 4. Rumbold AR, et al., Investigating a cluster Minh năm 2018. Tạp chí nghiên cứu Y học, of vulvar cancer in young women: a cross- 142(6), tr 78-85. sectional study of genital human 107