Tuyển tập Hội nghị Khoa học thường niên năm 2021. ISBN: 978-604-82-5957-0 NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ESTRIOL KHÔNG LIÊN HỢP (uE3) BẰNG PHƯƠNG PHÁP MIỄN DỊCH HUỲNH QUANG PHÂN LẬP THỜI GIAN (TRFIA) Trần Khánh Hòa Trường Đại học Thủy lợi, email: hoatk@wru.vn 1. GIỚI THIỆU CHUNG phương pháp TRFIA có độ nhạy, độ chính xác cao, tuyến tính trong phạm vi rộng [1]. Estriol (E3) là một trong ba dạng estrogen Nghiên cứu bước đầu đánh giá khả năng chính trong cơ thể người và hầu như chỉ xuất ứng dụng phương pháp TRFIA trong việc hiện trong thai kỳ do nhau thai tiết ra. Nồng độ định lượng nồng độ uE3 dựa trên phản ứng E3 trong huyết thanh của thai phụ phụ thuộc cạnh tranh giữa uE3 của mẫu và uE3 đánh vào tình trạng của thai nhi, chức năng của dấu Eu3+ với kháng thể đơn dòng uE3. bánh nhau và sức khỏe thai phụ [4]. Có 02 loại estriol trong huyết thanh thai phụ: estriol liên 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU hợp với sunfate và glucuronides và estriol không liên hợp (uE3), đặc hiệu do nhau thai Các hóa chất dùng trong nghiên cứu này đều tiết ra. Trong thai kỳ 2 (tuần thai từ 15 đến 20), là dạng tinh khiết dùng cho phân tích y sinh. nồng độ uE3 thay đổi theo thai kỳ và thường Hóa chất bao gồm: đĩa 96 giếng (bề mặt giảm ở những thai nhi mắc hội chứng Down. Polystyrene) (hãng Corner); Streptavidin 2,5 Sự kết hợp của uE3 với alpha-fetoprotein µg/mL; Dung dịch đệm phosphate buffer (AFP), human chorionic gonadotropin (hCG) solution (PBS) 0,01M có pH 4,9 chứa NaN3 hoặc beta human chorionic gonadotropin (beta 0,05%; Dung dịch khóa giếng bovine serum hCG) được sử dụng rộng rãi để tăng độ nhạy albumin (BSA) 1% (hãng Sigma Aldric); của sàng lọc hội chứng Down cho thai phụ ở kháng thể uE3 - biotin với các nồng độ khác thai kỳ 2 [1]. Định lượng nồng độ uE3 còn nhau, dung dịch tăng cường (Enhance được bác sỹ chỉ định cho phụ nữ có nghi ngờ solution), kháng nguyên cạnh tranh Eu3+- mắc ung thư vú và ung thư buồng trứng [2]. labeled uE3-BSA (50ng/mL), các dung dịch Có nhiều phương pháp được sử dụng để chuẩn uE3 (hãng Perkin Elmer (A, B, C, D, E, định lượng uE3 trong huyết thanh như: F có nồng độ lần lượt 0,00; 0,58; 1,09; 4,69; phương pháp sắc ký lỏng, phương pháp miễn 13,20 và 45,20 nmol/l) [3]. Thiết bị đo: máy đo dịch phóng xạ (RIA), phương pháp điện hóa huỳnh quang Victor 2D (hãng Perkin Elmer). phát quang (CLIA), phương pháp Elisa cạnh Định lượng uE3 bằng phương pháp tranh [1]… trong đó kỹ thuật miễn dịch huỳnh (TRFIA) gồm các bước cơ bản: quang phân lập thời gian (Time-resolved 1- Cố định Streptavidin trên giếng. Mỗi fluoroimmunoassay TRFIA) sử dụng nguyên giếng thêm 200 µL Streptavidin 2,5 µg/mL, ủ tố đất hiếm (Eu3+, Sm3+,…) để đánh dấu trong 4oC, rửa 2 lần bằng dung dịch nước (labeling) là phương pháp có nhiều ưu điểm muối NaCl 0,9%. Khóa giếng bằng cách và ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực y sinh. thêm 300 µL dung dịch BSA 1% trong PBS Huỳnh quang của các nguyên tố này có sự 0,01M, ủ trong 2h ở 4oC, rửa 6 lần bằng dung khác biệt lớn giữa đỉnh hấp thụ và phát xạ (lớn dịch PBS 0,01M. hơn 250 nm), thời gian phát quang kéo dài 2- Cố định kháng thể trên giếng polystyren (vài trăm micro giây), tín hiệu nền thấp nên thông qua liên kết Streptavidin và Biotin. 311
Tuyển tập Hội nghị Khoa học thường niên năm 2021. ISBN: 978-604-82-5957-0 Thêm 150 µL kháng thể uE3 - biotin vào mỗi Lựa chọn nồng độ kháng thể uE3-Biotin là giếng polystyrene được cố định streptavidin 0,75 µg/mL cho các khảo sát tiếp theo. trên bề mặt. Ủ 45 phút ở nhiệt độ phòng sau 3.2. Khảo sát độ lặp của phép phân tích đó rửa 2 lần bằng dung dịch PBS 0,01M. 3- Phản ứng cạnh tranh giữa uE3 của mẫu Độ lặp của phép phân tích được khảo sát với uE3 được đánh dấu huỳnh quang. Thêm với 10 thí nghiệm tương đương trên các chất đánh dấu và mẫu chuẩn vào giếng (tỉ lệ giếng với nồng độ dung dịch kháng thể uE3- thể tích 50:50 µL), tiếp tục ủ 1 tiếng ở nhiệt biotin 0,75 µg/mL với chuẩn D (uE3= 4,69 độ phòng sau đó rửa 6 lần bằng dung dịch nmol/L). Cường độ huỳnh quang thu được PBS 0,001M. được trình bày trong Bảng 1. 4- Thêm 200 µL dung dịch tăng cường và đo cường độ huỳnh quang thu được trên máy Bảng 1. Cường độ huỳnh quang của dung Victor 2D. dịch kháng thể uE3 - Biotin 0,75 µg/mL và Nghiên cứu đã khảo sát ảnh hưởng của nồng độ mẫu chuẩn D (uE3= 4,69 nmol/l) nồng độ kháng thể uE3-biotin, độ lặp, giới Cường độ Cường độ hạn phát hiện, giới hạn định lượng và xây STT STT huỳnh quang huỳnh quang dựng được đường chuẩn của phép phân tích. 1 9888 6 10725 2 10605 7 9650 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3 9559 8 8947 3.1. Ảnh hưởng của nồng độ kháng thể 4 9411 9 10526 uE3 - Biotin 5 9539 10 9169 Nghiên cứu đã khảo sát với 9 nồng độ Độ lệch chuẩn (SD) = 620; Hệ số biến thiên khác nhau của kháng thể uE3 - Biotin (0,50; (CV) = 3,2%. Giá trị này khá tương đồng với 0,75; 1,00; 1,50; 2,50; 3; 4; và 5 µg/mL) với giá trị CV dao động từ 3,3% - 10,3% của kit mẫu chuẩn A (uE3 = 0). Kết quả được trình uE3 của nhà sản xuất Perkin Elmer (Mỹ) [3]. bày trong Hình 1. 3.3. Xây dựng đường chuẩn Sử dụng loại giếng đã được cố định kháng thể ở các điều kiện tối ưu (nồng độ kháng thể uE3-Biotin là 0,75 µg/mL) để đo huỳnh quang của 6 mẫu kháng nguyên uE3 chuẩn A, B, C, D, E, F. Cường độ huỳnh quang đo được được trình bày trong Bảng 2 dưới đây: Bảng 2. Cường độ huỳnh quang đo được với Hình 1. Sự phụ thuộc cường độ huỳnh quang 6 mẫu chuẩn uE3 với nồng độ kháng thể vào nồng độ kháng thể uE3 - Biotin uE3- biotin là 0,75 µg/mL Khi nồng độ kháng thể uE3 - Biotin tăng Nồng độ Cường độ Logarit từ 0,5 µg/mL đến 2,5 µg/mL thì cường độ Mẫu mẫu chuẩn huỳnh cường độ huỳnh quang tăng và đạt cực đại. Sau đó, (nmol/L) quang huỳnh quang cường độ giảm mạnh khi tăng nồng độ lên 5 A1 0,00 32168 4,507 µg/mL, có thể do sự chồng xếp lên nhau của A2 0,58 23866 4,378 các kháng thể uE3-biotin. Như vậy, có thể sử A3 1,09 19149 4,282 dụng được khoảng nồng độ kháng thể uE3 - A4 4,69 9888 3,995 Biotin từ 0,5 µg/mL đến 2,5 µg/mL để cố định các kháng thể uE3 - biotin lên trên bề A5 13,2 5001 3,699 mặt giếng polystyrene có gắn streptavidin. A6 45,2 2449 3,406 312
Tuyển tập Hội nghị Khoa học thường niên năm 2021. ISBN: 978-604-82-5957-0 Đường chuẩn phân tích uE3 được xây 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ dựng trên cơ sở hồi quy phi tuyến, biểu diễn Nghiên cứu bước đầu đã cố định được sự phụ thuộc của logarit nồng độ huỳnh kháng thể uE3 lên bề mặt giếng polystyren quang theo nồng độ của các mẫu chuẩn. dựa trên liên kết Streptavidin và Biotin. Phương trình đường chuẩn: Khảo sát và xác định được nồng độ kháng y = y0 + A1e - x/t1 + A 2e- x/t2 + A 3e- x/t3 thể uE3-Biotin uE3 cố định là 0,75 µg/mL y0 = -1,62124; A1 = 3,1916.1014; cho tín hiệu huỳnh quang tốt nhất. t1 = 0,10888; A2 = 3,1916.1014; Đánh giá độ lặp của phép phân tích với mẫu t2 = 0,10888; A3 = 297741,97932; uE3 chuẩn có nồng độ 4,69 nmol/L cho hệ số t3 = 0,37043 biến thiên CV = ± 3,2%, gần với giá trị CV của kit uE3 thương mại của hãng Perkin Elmer. 3.4. Xác định giới hạn phát hiện (LOD) Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới và giới hạn định lượng (LOQ) hạn định lượng (LOQ) dựa trên độ lệch Nghiên cứu đo dung dịch kháng thể uE3- chuẩn của tín hiệu dung dịch mẫu trắng. Kết Biotin 0,75 µg/mL với mẫu chuẩn A. quả thu được: LOD = 0,2729 nmol/L và LOQ Giá trị cường độ huỳnh quang của 10 mẫu = 0,8269 nmol/L. Giá trị này gần tương đồng trắng được thể hiện trong Bảng 3 dưới đây. với giá trị LOD và LOQ của kit uE3 đã được thương mại hóa của hãng Perkin Elmer. Bảng 3. Cường độ huỳnh quang Trong thời gian tới, nghiên cứu sẽ khảo sát của 10 mẫu chuẩn A thêm ảnh hưởng của các steroid. Các steroit Cường độ Cường độ là các nội tiết tố của phụ nữ (progesterone Giếng Giếng testosterone,… Các nội tiết tố này thay đổi huỳnh quang huỳnh quang tùy theo chu kỳ kinh nguyệt hoặc trong thời 1 34784 6 33049 kỳ mang thai. Về cấu trúc hóa học, các steroit 2 32168 7 30049 có cấu trúc gần tương tự nhau nên việc khảo 3 36448 8 38275 sát độ đặc hiệu có ý nghĩa quan trọng trong phân tích từng steroit, trong đó có uE3. 4 35025 9 34953 5 32792 10 35251 5. TÀI LIỆU THAM KHẢO Giá trị trung bình: 34279 1. Analytical Methods, A direct competitive Độ lệch chuẩn: SD = 2332 inhibition time-resolved fluoroimmunoassay for the detection of unconjugated estriol in Sử dụng phần mềm Origin, biểu diện sự serum of pregnant women; Yong-ping phụ thuộc cường độ huỳnh quang vào nồng Tang, Su-qing Zhao, Ying-song Wu, Jian- độ mẫu chuẩn: y = a + b.rx wei Zhouc and Ming Li, 2013, 5, 4068. Với a = 4845; b = 28202 và r = 0,56505 2. Clinical Chemistry, Measurement of Kết quả phân tích thu được giá trị LOD = Unconjugated Estriol in Serum by Liquid 0,2729 nmol/L, giá trị LOQ = 0,8269 nmol/L Chromatography Tandem Mass Spectrometry tương đương với giá trị LOD = 0,3 nmol/L and Assessment of the Accuracy of nhưng cao hơn giá trị LOQ = 0,4 nmol/L của Chemiluminescent Immunoassays, Xianzhang kit định lượng uE3 của hãng Perkin Elmer. Huang, David C. Spink, Erasmus Schneider, Mặc dù giá trị LOQ cao hơn so với kit xét Helen Ling, Alex J. Rai, Thomas G. Rosano, Baorong Chen,6 and Zhimin (Tim) Cao, nghiệm uE3, nhưng sự chênh lệch là không 260-268 (2014). nhiều nên hoàn toàn có thể ứng dụng phương 3. Perkin Elmer, 2012, Delfia/AutoDELFIA pháp này để định lượng nồng độ uE3 trong unconjugated estriol (uE3) kit, B095-101. huyết thanh của thai phụ ở thai kỳ 2. 4. Võ Văn Đức, 2010, Tài liệu hướng dẫn sàng lọc & chẩn đoán trước sinh, Trường đại học Y Dược Huế. 313