KỶ YẾU ỨNG DỤNG KĨ THUẬT HÓA MÔ MIỄN DỊCH TRONG CHẨN ĐOÁN, PHÂN LOẠI UNG THƯ VÚ VÀ ĐỊNH HƯỚNG ĐIỀU TRỊ Trần Đức Hùng*, Nguyễn Quang Trung* , Nguyễn Thị Giang An**, Trần Thị Tuyển** * Bệnh viện Ung Bướu Nghệ An Khoa Sinh – Đại học Vinh ** TÓM TẮT Ung thư vú (UTV) là một trong những loại ung thư thường gặp và diễn biến phức tạp nhất ở phụ nữ. Sự đa dạng của UTV đã gây khó khăn cho việc lựa chọn phác đồ điều trị cụ thể. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài này là: sử dụng thành tựu của công nghệ y sinh, thông qua các marker phân tử theo nguyên lý miễn dịch để chẩn đoán, phân loại ung thư biểu mô tuyến vú. Trên cơ sở đó nhằm tiên lượng và định hướng điều trị cho bệnh nhân. Khảo sát 75 trường hợp ung thư biểu mô tuyến vú (UTBMTV) kết quả cho thấy: độ tuổi bị bệnh cao nhất là 50-59 (40%), vị trí khối u trái là 53,3%, phải (46,7%), trong đó 40% bệnh nhân có hiện tượng di căn sang hạch nách. Khi phân loại mô học học cho thấy UTBMTV phân bố trên các thể khác nhau, trong đó phổ biến nhất là thể ống xâm nhập (73,3%). Trong 55 trường hợp UTBM thể ống xâm nhập tỉ lệ độ mô học I, II lần lượt là 27,3% và 72,7%. Kết quả hóa mô miễn dịch (HMMD) ở những bệnh phẩm UTBMTV biểu hiện ER+, PR+, HER -2+ với tỉ lệ lần lượt 38,7%, 66,7%, 32%. Phân nhóm UTV cho thấy: tỷ lệ nhóm 1A là 12 %; 1B là 12 %; 1C là 1,3%; 2A là 24,0%; 2B là 18,7%; 2C là 2,6%; ER/PR-,HER2+(8%); ER/PR-, HER2- (22,7%). SUMMARY Breast cancer is one of the most common and the most complicated cancers in women. The variety of breast cancer has made it to be difficult for selecting a specific treatment regimen. Objective of this study is to use achievements of the biomedical engineering through principles of immunological markers for diagnosis and classification of breast carcinoma, therefore, to predict and orient treating for patients. Results of survey on 75 cases concerning breast carcinoma showed that the highest age of patients is from 50 to 59 year older (accounted for 40 %); tumor location was large on the left (53.3%), whereas on the right was 46.7%); 40% of total patients expressed to metastasize to theaxillary lymph nodes. The histological classification denoted that the breast carcinoma appears in different places, in which the most common is in the penetrated ductal (causing the mammary ductal carcinoma, 55 cases, accounted for 73.3%). Of 55 cases of mammary ductal carcinoma, the rate I and II of histology were by 27.3% and 72.7%, respectively. The results of immunohistochemistry on specimens of breast carcinoma with ER+, PR+, and HER-2+ expresses were by 38.7%, 66.7%, 32%, respectively. Following grouping of breast carcinoma, subgroups 1A, 1B, 1C, 2A, 2B, 2C, ER/PR-, HER2 and ER/PR-, HER2- accounted for 12%, 12%, 1.3%, 24.0%, 18.7%, 2.6%, 8%, and 22.7%, respectively. I. ĐẶT VẤN ĐỀ Trong chẩn đoán ung thư vú, mô bệnh học thông Ung thư vú là một trong những ung thư thường thường (nhuộm HE) được xem là tiêu chuẩn vàng gặp nhất ở phụ nữ trên thế giới cũng như ở Việt Nam. nhưng việc chẩn đoán bằng mô học chủ yếu dựa vào Ở Châu Âu, năm 2006 có khoảng 3,2 triệu người được hình thái và cấu trúc mô học của tế bào. Trong khi đó, chẩn đoán ung thư và 1,7 triệu người đã tử vong, trong các tế bào ung thư có thể biểu hiện hình thái giống đó ung thư vú chiếm 13,5% [4]. Tại Việt Nam trong nhau nhưng lại có nguồn gốc khác nhau. Vì thế các những năm gần đây tỷ lệ ung thư vú có xu hướng tăng nhà giải phẫu bệnh gặp nhiều khó khăn trong việc xác dần. Theo Nguyễn Bá Đức, ở Hà Nội năm 1998 có định rõ nguồn gốc tế bào. Sự ra đời và phát triển của 20,3/100.000 phụ nữ, vào các năm 2001-2004 tăng kỹ thuật HMMD là một trong những chỉ định để xác lên 29,7/100.000. Theo Nguyễn Chấn Hùng, ở Thành định rõ tính chất sinh học của quần thể tế bào trong phố Hồ Chí Minh, năm 1998 có 16/100.000, năm cùng một dòng nhưng chức năng khác nhau. Theo 2003 tỷ lệ này 19,4/100.000 [4]. đó, HMMD có thể giúp các bác sĩ lựa chọn phác đồ 532
HỘI NGHỊ KHOA HỌC NGÀNH Y TẾ NGHỆ AN MỞ RỘNG - 2015 điều trị và tiên lượng diễn biễn của bệnh. Bên cạnh đó II. ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU HMMD còn hỗ trợ cho việc điều trị đúng đích, nhằm 1. Đối tượng, phương pháp nghiên cứu nâng cao hiệu quả điều trị và tránh tổn thương cho các tế bào lành. Trong nước, HMMD đã được triển khai ở 2.1. Đối tượng nhiều cơ sở y tế lớn. Tại Bệnh viện Ung Bướu Nghệ Đối tượng nghiên cứu gồm 75 bệnh nhân ung thư An, HMMD bước đầu đã được ứng dụng tại phòng xét biểu mô tuyến vú đã được khám và điều trị tại Bệnh nghiệm Giải phẫu bệnh-Tế bào nhằm mục đích chẩn viện Ung Bướu Nghệ An từ tháng 4/2013 đến tháng đoán, phân loại và định hướng điều trị cho các bệnh lý 6/2013. Số bệnh nhân này đã được xác định về các ung thư, đặc biệt là ung thư vú. Vì vậy chúng tôi tiến đặc điểm lâm sàng, mô bệnh học thông thường và hành đề tài “Ứng dụng kỹ thuật HMMD trong chẩn phân loại UTV tại khoa Giải phẫu bệnh - Bệnh viện đoán, phân loại ung thư vú và định hướng điều trị” Ung Bướu Nghệ An. với các mục tiêu: 2.2. Phương pháp nghiên cứu: phương pháp nghiên - Đánh giá sự biểu hiện của 3 marker chính: ER cứu mô tả. (Estrogene receptor), PR (Progesterone receptor), Her- 2.3.Phương pháp chọn mẫu: chọn mẫu có chủ định, 2/neu (Human epidermal growth factor receptor 2). thuận tiện, không chọn mẫu ngẫu nhiên. - Đánh giá mối tương quan giữa sự biểu hiện của 2. Vật liệu nghiên cứu các marker với nhau và với các yếu tố lâm sàng. 2.1. Các kháng thể, dung dịch đệm rửa, bộc lộ - Phân nhóm phân tử ung thư vú dựa vào sự biểu kháng nguyên và hệ thống phát hiện của hãng Dako hiện của các marker và định hướng điều trị. Cytomation (Đan Mạch) * Các kháng thể sử dụng: Bảng 1. Các loại kháng thể sử dụng Tên gốc Kháng thể đơn dòng Tỷ lệ pha loãng Chứng dương tính DB053RTU-7anti ER Từ chuột kháng người 1: 40 Vú (ER) DB053RTU-7anti PR Từ chuột kháng người 1: 40 Vú (PR) DB053RTU-7anti C-erb-2 Từ chuột kháng người 1: 50 Vú (Her-2/neu) (ER: Estrogen receptor; PR: Progesteron 2.3. Mô bệnh học thông thường: mẫu được xử lý và receptor; Her2/neu: Human epidermal growth factor đúc trong paraffin và cắt từ 3µ, cố định lên lam kính receptor 2) và nhuộm HE (Sheehan D.C và Hrapchak, 1980). * Dung dịch đệm rửa và bộc lộ kháng nguyên 2.4. Phân loại mô học: dựa trên tiêu chuẩn phân loại + Tris-Buffered Saline , pH 7.6 của WHO 2003. Phân độ mô học UTBMTV thể ống xâm nhập theo Scraff Blom Richardson, cải tiến bởi + Peroxidase Retrieval Solution, pH 9.0, Concentrated × 10 (S2367) Elston và Ellis (1991). * Hệ thống phát hiện 2.5. Hoá mô miễn dịch: tiêu bản được cắt 3µ và ủ qua đêm. Sau đó, tiến hành tẩy paraffin bằng xylen, + EnVisionTM Detection Systems cồn (70o, 90o,100o). Bộc lộ kháng nguyên với pH = 6 + Peroxidase/ DAB, Rabbit/Mouse (K5007) ở nhiệt độ 90-95oC trong 15 phút; khử peroxydase nội 2.2. Mẫu vật: Sử dụng các mẫu tiêu bản mô bệnh học sinh bằng H2O2 3% trong 10 phút. Ủ kháng thể 1 (ER, và các khối nến lưu trữ bệnh phẩm của 75 bệnh nhân PR, HER-2) trong 60 phút, rửa bằng TBS. Ủ kháng đã được xác định UTBMTV bằng kỹ thuật hóa mô tại thể 2 trong 30 phút, sau đó nhỏ dung dịch DAB, rửa Bệnh viện Ung Bướu Nghệ An. bằng TBS. Cuối cùng nhuộm hematoxylin. 533
KỶ YẾU Đánh giá kết quả nhuộm HMMD * Đối với ER, PR: sử dụng kháng thể đơn dòng từ chuột. Đánh giá kết quả theo thang điểm Allred, dựa vào tỷ lệ và cường độ bắt màu cúa tế bào u như sau: Tỷ lệ bắt màu (PS) Cường độ bắt màu (IS) Mức độ 0 1/100 1/10 1/3 2/3 1 Không Yếu Vừa Mạnh Điểm 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 Tổng điểm = PS + IS; Dương tính: tổng điểm >0 * Cách đánh giá thụ thể Her2: sử dụng kháng thể thỏ đa dòng kháng người. Đánh giá theo tiêu chuẩn của Dako, dựa trên khả năng bắt màu của màng tế bào u. Mẫu dương tính là mẫu có cường độ bắt màu 2(+) và 3(+). 3. Phân tích số liệu thống kê: các số liệu được phân tích bằng phần mềm SPSS 16. III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 1. Tuổi mắc bệnh Bảng 1: Đặc điểm và mối liên quan tuổi UTBMTV với các marker phân tử Nhóm tuổi 30-39 40-49 50-59 60-69 70-79 80-89 11 19 30 9 5 1 r p Số bệnh nhân (14,5%) (25,3%) (40%) (12%) (6,6%) (1,3%) ER(+) SL 5 7 12 2 2 1 0,02 0,989 (n=29) Tỷ lệ 17,2 24,1 41,4 6,9 6,9 3,4 PR(+) SL 7 14 20 5 3 1 0,05 0,658 (n=50) Tỷ lệ 14,0 28,0 40,0 10,0 6,0 2,0 HER2(+) SL 2 9 9 2 2 0 -0,08 0,473 (n=24) Tỷ lệ 8,3 37,5 37,5 8,3 8,3 0,0 2. Kích thước và vị trí khối u Bảng 2: Đặc điểm khối u và mối liên quan với các marker phân tử ER (+) PR (+) HER2 (+) Đặc điểm Tỷ lệ n SL Tỷ lệ SL Tỷ lệ SL Tỷ lệ T < 2cm 14 18,67 6 21,4 9 19,1 4 18,2 2cm < T < 3cm 19 25,33 9 32,1 14 29,8 3 13,6 Kích thước 3cm < T < 4cm 26 34,67 7 25,0 17 36,2 12 54,5 khối u 4cm < T < 5cm 10 13,33 4 14,3 4 8,5 3 13,6 (n=75) T > 5cm 1 1,33 0 0,0 1 2,1 0 0,0 Không rõ TT 5 6,67 2 7,1 2 4,3 0 0,0 Vị trí u Phải 35 46,7 12 41,4 25 50 14 58,3 (n=75) Trái 40 53,3 17 58,6 25 50 10 41,7 Không di căn 31 37,9 11 44 22 29,3 7 29,2 < 3 hạch 11 24,1 7 16 8 10,7 3 12,5 Di căn hạch > 3 hạch 25 31,0 9 30 15 20 12 50,0 (n=75) Không rõ TT 8 6,9 2 10 5 6,7 2 8,3 p 0,869 0,412 0,049 534
HỘI NGHỊ KHOA HỌC NGÀNH Y TẾ NGHỆ AN MỞ RỘNG - 2015 3. Kết quả mô bệnh học Bảng 3: Phân loại và phân độ mô bệnh học Tổng ER (+) PR (+) HER2 (+) Đặc điểm n Tỷ lệ SL Tỷ lệ SL Tỷ lệ SL Tỷ lệ Thể ống xâm nhập 55 73,3 22 75,9 39 78,0 17 70,8 Thể ống nhỏ 11 14,7 5 17,2 4 10,3 2 8,3 Thể nội ống 2 2,6 0 0,0 2 50,0 2 8,3 Thể trứng cá 1 1,3 1 3,4 1 50,0 1 4,2 Phân loại mô Thể tiểu thùy xâm nhập 1 1,3 0 0 0 0 0 0 bệnh học Thể tiểu thùy 1 1,3 0 0 0 0 0 0 (n=75) Thể tủy 1 1,3 0 0 1 2,0 0 0,0 Thể nhày 1 1,3 1 3,4 1 2,0 1 4,2 Thể vi nhú xâm nhập 1 1,3 0 0 1 2,0 1 4,2 Tuyến nhú 1 1,3 0 0 1 2,0 0 0 p 0,659 0,300 0,653 Biệt hóa rõ (Độ I) 15 27,3 5 6,7 9 12,0 3 4,0 Độ mô học Biệt hóa vừa (Độ II) 40 72,7 17 22,7 30 40,0 14 18,7 ( 55 TH thể ống Biệt hóa kém (Độ III) 0 0 0 0 0 0 0 0 xâm nhập) r 0,083 0,147 0,145 p 0,545 0,284 0,292 4. Kết quả nhuộm hóa mô miễn dịch Bảng 4: Tỷ lệ biểu hiện của các marker phân tử ER (+) PR (+) HER2 (+) Đặc điểm SL Tỷ lệ SL Tỷ lệ SL Tỷ lệ Dương tính 1(+) 17 22,7 20 26,7 18 24,0 Dương tính 2(+) 7 9,3 12 16 7 9,3 Dương tính Dương tính 3(+) 5 6,7 18 24 17 22,7 Tổng 29 38,7 50 66,7 42 56,0 p Âm tính 46 61,3 25 33,3 33 44 Bảng 5: Phân nhóm ung thư biểu mô tuyến vú Các marker SL Tỷ lệ Tổng số r p (1A):ER+/PR+,HER2+ 9 12,0 Nhóm 1 ER/PR (1B): ER-/PR+,HER2+ 9 12,0 24 % r (Her2, ER) = -0,016 0,889 (+) HER-2(+) (1C): ER+/PR-,HER2+ 0 0,0 (2A): ER+/PR+,HER2- 18 24,0 Nhóm 2 ER/ 45,3 % (2B): ER-/PR+,HER2- 14 18,7 r (PR, ER) = 0,445 ** 0,000 PR(+), HER2 (-) (2C): ER+/PR-,HER2- 2 2,7 Nhóm 3 ER/PR (-), HER2 (+) 6 8,0 8% Nhóm 4 ER /PR(-), HER2 (-) 17 22,7 22,7 r (PR, HER2)= 0,121 0,300 535
KỶ YẾU IV. BÀN LUẬN tỷ lệ 8%, song đây là phân nhóm có đáp ứng điều Theo kết quả nghiên cứu của Onitilo AA và cs trị nhưng tiên lượng xấu. Nghiên cứu của Đoàn Thị năm 2009, căn cứ vào sự biểu hiện đồng thời của các Phương Thảo và cs năm 2011 trên nhóm này cho tỷ lệ marker ER, PR và HER2 đã chia UTBMTV làm 4 17,9%. Phân nhóm ER/PR(-)HER2- chiếm 22,7% là nhóm chính: nhóm 1: ER/PR(+)HER2(+) phù hợp phân nhóm không có sự biểu hiện của nội tiết và gen với kiểu hình ống B (Luminal B); nhóm 2: ER/PR(+) HER2/new, do vậy cần xét nghiệm thêm với marker HER2(-) phù hợp với kiểu hình ống A (Luminal A); phát hiện cytokeratin (CK5/6, CK7...) để phát hiện sự nhóm 3: ER/PR(-)HER2(+) gọi là kiểu hình HER2 và biểu hiện gen BRCA. Nếu kết quả âm tính được xem nhóm 4: ER/PR(-)HER2(-) gọi là bộ ba âm tính phù như tuyến u vú bình thường. hợp với kiểu hình giống đáy (basal-like). Trong công Xét về giới tính cho thấy, UTV chỉ xuất hiện ở nữ trình nghiên cứu này, chúng tôi cũng đã phân loại giới, mặc dù các công trình nghiên cứu khác đã chỉ ra UTBMTV làm 4 phân như trên. Với sự phân chia này UTV có thể xuất hiện ở cả nam giới, tuy nhiên tỷ lệ đã tạo thành các phân nhóm đáp ứng với sự biểu hiện mắc rất thấp. UTV xuất hiện với tỷ lệ cao ở độ tuổi của nội tiết hoặc sự khuếch đại của gen Her 2/neu. 50-59 (40%); tiếp đến là nhóm tuổi 40-49 (25,3%), Nghiên cứu về ý nghĩa biểu hiện của các thụ không có trường hợp nào ở độ tuổi dưới 30 (bảng 1). thể estrogen (ER) và progesteron (PR) Allred và cs Như vậy, độ tuổi mắc bệnh trung bình 51,9 + 11,9, (1998) cho rằng 2 thụ thể này có vai trò quyết định đây là độ tuổi mãn kinh. Vì thế, sự rối loạn về hormon đáp ứng 70% liệu pháp nội tiết. Chính vì vậy, nếu cắt nội tiết đã góp phần gia tăng tỷ lệ UTV. Kết quả này bỏ nguồn sản xuất estrongen thì bệnh nhân sẽ có đáp phù hợp với các nghiên cứu của các tác giả khác [1], ứng lâm sàng giống như điều trị bằng thuốc kháng [2], [3], [4]. nội tiết. HER2 là một thụ thể glycoprotein trên màng Nghiên cứu về vị trí tổn thương do UTV, thường tế bào được tổng hợp từ proto–oncogen Her-2/neu, gặp ở vú trái nhiều hơn vú phải. Vị trí tổn thương UTV nằm tại vị trí 21 trên nhiễm sắc thể 17. Sự biểu hiện không được xem là yếu tố tiên lượng và định hướng quá mức của thụ thể này trong UTBMTV là một tiên điều trị bệnh. Kiểm tra kích thước khối u sau phẫu lượng xấu, đặc biệt là trong nhóm bệnh nhân có di thuật cho thấy, khối u có kích thước từ 3
HỘI NGHỊ KHOA HỌC NGÀNH Y TẾ NGHỆ AN MỞ RỘNG - 2015 III chiếm ưu thế (50%), độ II chiếm 44,3%. mô học và độ mô học. Bên cạnh đó, tỷ lệ bệnh nhóm có hiện tương di căn hạch cao (chiếm 55,1%). Kết V. KẾT LUẬN quả này cho thấy, sự đa dạng sinh học của ung thư vú, Căn cứ vào các marker phân tử trong HMMD các phân nhóm này giúp định hình các nguy cơ cũng chúng tôi đã chia UTBMTV thành 4 phân nhóm. như tiên lượng diễn biến của bệnh. Đây là nghiên cứu Sự biểu hiện nhóm ER/PR(+)HER2(-) chiếm tỷ lệ bước đầu cung cấp những dữ liệu phân tử với mong cao nhất (45,3%), nhóm PR dương tính 66,7%, ER muốn hỗ trợ cho điều trị ngày càng tốt hơn. Hy vọng dương tính 38,7%, Her-2+ 32,0%; phân nhóm ER/ trong những nghiên cứu dài hơn, theo dõi đáp ứng PR(-) HER2(+) chiếm tỷ lệ 8% và phân nhóm ER/ điều trị của bệnh nhân cũng như diễn tiến của bệnh, PR(-)HER2- chiếm 22,7%. Các phân nhóm này có sự chúng ta sẽ cung cấp thêm những yếu tố nguy cơ tái khác biệt về độ tuổi biểu hiện, kích thước khối u, loại phát, di căn, đáp ứng điều trị. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Adedayo A. Onitilo, Jessica M. Engel, nhập”, Y Học TP. Hồ Chí Minh, 15 (2), tr. 107-113. Robert T. Greenlee and Bickol N. Mukesh (2009), 3. Đặng Công Thuận, 2012. “Hóa mô miễn dịch “Breast Cancer Subtypes Based on ER/PR and trong ung thư vú”. Tạp chí Phụ sản, tập 10, số 3, tr74- Her2 Expression: Comparison of Clinicopathologic Features and Survival” Clinical Medicine & Research, 83. Volume 7, Number 1/2: 4-13 4. Đoàn Thị Phương Thảo, 2011. “Nghiên cứu 2. Đặng Công Thuận, Nguyễn Phúc Duy Quang, gen Her -2/neu và phân loại phân tử ung thư vú”. 2011. “Nghiên cứu sự bộc lộ ER, PR, HER2 và nồng Luận án tiến sĩ y học. Đại học Y dược thành phố Hồ độ CA 15-3 trong ung thư biểu mô tuyến vú xâm Chí Minh. 537